Powtarzająca się dominująca negatywna mutacja E47 powoduje agammaglobulinemię i BCR Komórki B. cd

Identyfikacja identycznej mutacji de novo u wszystkich 4 pacjentów była nieoczekiwana, ale zgodna z niedawnymi badaniami wskazującymi, że mutacje de novo nie występują przypadkowo. Niektóre witryny, w tym istotne geny, są bardziej wrażliwe niż inne (15, 16). Funkcjonalne konsekwencje mutacji E555K oceniono w transformowanych EBV liniach komórek B od 2 pacjentów. Ilościowa reakcja PCR wykazała, że ilości transkryptów E12 i E47 w liniach komórkowych pacjentów były porównywalne z ilościami stwierdzonymi w liniach komórkowych EBV od zdrowych osób z grupy kontrolnej lub pacjentów z mutacjami w BTK (Figura 2A). W celu określenia, czy mutacja w zmienionej stabilności białka E47, całkowite lizaty komórkowe z linii EBV poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko E47 i wywołano je przeciwciałem poliklonalnym, które reagowało zarówno z E12 jak i E47 (Figura 2B). Chociaż ilość E47 w liniach EBV była zmienna, linie pacjenta były podobne do linii kontrolnych. Zdolność ekstraktów jądrowych z linii EBV do wiązania się z klasycznym docelowym miejscem DNA dla białek E, mysiego wzmacniacza E5, analizowano za pomocą EMSA. Widoczny był słaby sygnał, używając ekstraktów jądrowych z linii kontrolnych, ale nie linii od pacjentów E555K. Ten sygnał nie był widoczny, gdy ekstrakty były wstępnie inkubowane z przeciwciałem anty-E47 (Figura 2C). Figura 2 Stabilność zmutowanego transkryptu i białka. (A) Ilościowy RT-PCR zastosowano do oceny ilości transkryptów E47 (lewy) i E12 (prawy) w transformowanych EBV liniach komórkowych od kontroli (czarne słupki), pacjentów z mutacją E555K w E47 (szare paski), lub pacjenci z mutacjami w BTK (białe słupki). (B) Całkowite lizaty komórkowe z komórek transformowanych 5×107 EBV poddano immunoprecypitacji z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko E47 lub niespokrewnionemu dopasowanemu izotypowi przeciwciału, a następnie wywołano je przeciwciałem, które rozpoznaje obie izoformy E2A. Strzałka wskazuje pasmo specyficzne dla E47. (C) Ekstrakty jądrowe z tych samych linii EBV pozostawiono bez leczenia lub preinkubowano z anty-E47, a następnie umożliwiono wiązanie wzmacniacza immunoglobuliny AE5 w EMSA. Wyciągi jądrowe z komórek HEK-293 transfekowanych E47 typu dzikiego działały jako kontrola pozytywna. Swoistość kompleksu białko / DNA wykazano przez supershifting z przeciwciałem do E47. Aby dodatkowo zbadać konsekwencje mutacji E555K w E47, komórki HEK-293 transfekowano wektorami ekspresyjnymi napędzanymi CMV, kodującymi E46 typu E12 lub E47 typu E55 lub E47555 mutanta E555K. Western bloty wykazały, że mutant E47 może lokalizować się normalnie w jądrze, że monoklonalne przeciwciało anty-E47 było specyficzne dla E47 i że to przeciwciało rozpoznało zmutowane białko, jak również E47 typu dzikiego (Figura 3A). Rysunek 3Funkcjonalne konsekwencje mutacji E555K
[przypisy: olej z konopii indyjskiej opinie, czynniki ryzyka chorób układu krążenia, szczepionka na meningokoki cena ]
[hasła pokrewne: centrum medyczne radzymin, acai berry 900 cena apteka, szczepionka na meningokoki cena ]