Powtarzająca się dominująca negatywna mutacja E47 powoduje agammaglobulinemię i BCR Komórki B. czesc 4

Wyciągi cytoplazmatyczne i jądrowe z komórek HEK-293 transfekowanych pustym wektorem lub wektory ekspresyjne dla E47, E47 lub E47555 mutanta E555K oceniano metodą Western blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla E47, przeciwciała, które rozpoznaje oba E12 i E47 lub przeciwciała przeciwko znanym białkom cytoplazmatycznym lub jądrowym. (B) EMSA przeprowadzono stosując znakowaną 32P sondę E5 i ekstrakty jądrowe z komórek HEK-293 transfekowanych wektorami wytwarzającymi mutanta E47 typu dzikiego E34, E47 lub E555K. Dziki typ i zmutowane prążki E47, ale nie prążki E12, przesiano z przeciwciałem do E47. (C, po lewej) Ekstrakty jądrowe z komórek transfekowanych zmiennymi ilościami (0 do 500 ng, jak wskazano u góry każdej ścieżki) mutanta E47 typu dzikiego i / lub E555K inkubowano z sondą AE5. Procent wiązania każdego ekstraktu pokazano poniżej każdej linii. Wpływ mutacji E555K u pacjenta heterozygotycznego jest modelowany w C (środkowy i prawy). Komórki HEK-293 transfekowano 250 ng mutanta E475 typu dzikiego lub E555K lub 125 ng każdego wektora. Ekstraktom jądrowym z tych komórek pozwolono związać się z sondą AE5, a procent wiązania określono przez fosfoimager (centrum). Konstrukt reportera wzmacniacza lucyferazy immunoglobuliny i 250 ng E47 E47, mutanta E555K E47 lub 125 ng każdego wektora transfekowano do komórek HEK-293 i zmierzono lucyferazę. (D) Ekstrakty jądrowe zawierające MyoD, E47 typu dzikiego, mutanta E47 lub kombinacje tych białek pozostawiono do związania się z sondą kinazy kreatyninowej (po lewej). Ekstrakty jądrowe preinkubowano przeciwciałem E47 lub MyoD w celu superskoku kompleksów DNA-białko (po prawej). Strzałki wskazują pasma specyficzne dla MyoD / E47. Wyciągi jądrowe z komórek HEK-293 transfekowanych pustym wektorem lub wektorami ekspresyjnymi produkującymi E45 typu E12 lub E47 E555K typu dzikiego inkubowano z sondą E5 w EMSA. Jak pokazano na Figurze 3B, E12 i E47 typu dzikiego dostarczały silnych sygnałów, ale zmutowany E47 dał sygnał, który był konsekwentnie mniejszy niż 5% obserwowanego dla E47 typu dzikiego. EMSA przeprowadzone przy użyciu tej samej sondy E5 i ekstraktów jądrowych z komórek HEK-293 transfekowanych dzikimi lub zmutowanymi wektorami E47 lub zmiennymi ilościami każdego wektora, wykazały, że dodanie E555K E47 do białka typu dzikiego znacznie zmniejszyło sygnał przez białko typu dzikiego. Wyniki te wskazują, że E555K E47 ma silny dominujący negatywny wpływ, gdy wiąże się z sondą jako homodimer z E47 typu dzikiego (Figura 3C). Aby naśladować stan heterozygotyczny, sondę E5 inkubowano z ekstraktami jądrowymi z komórek HEK-293 transfekowanych 500 ng typu dzikiego lub zmutowanym E47 lub 250 ng każdego z nich. Intensywność sygnału uzyskanego za pomocą ekstraktu symulującego stan heterozygotyczny wynosiła 13% wartości obserwowanej dla białka typu dzikiego (ryc. 3C)
[patrz też: narodowy fundusz zdrowia skierowania, rezonans magnetyczny kraków cennik, leki przeciwhistaminowe iii generacji ]
[przypisy: dna moczanowa leczenie ziołami, wanted ścigani cda, rezonans magnetyczny kraków cennik ]