Sekwencjonowanie exome ujawnia mutację MCM8, która jest przyczyną niewydolności jajników i niestabilności chromosomów ad 5

Komórki HEK293T transfekowano MCM8-GFP dzikiego typu (WT) lub zmutowanym MCM8-GFP (p.P149R, pokazano na zielono) i traktowano 300 nM MMC przez 6 godzin. Nuklei wybarwiono kontrastowo DAPI (niebieski). Ogniska powstają w komórkach 293T eksprymujących MCM8 typu dzikiego, ale nie w komórkach wyrażających zmutowany MCM8. Wykonano cztery niezależne doświadczenia dla transfekcji MCM8-GFP (WT vs. p.P149R) sprzężone z uszkodzeniem DNA. Przedstawiono reprezentatywne obrazy konfokalne. (B) Dwadzieścia reprezentatywnych komórek na warunek oceniono ilościowo dla liczby wywołanych uszkodzeniem ognisk jądrowych. Dwutonowy test t (zakładając nierówną wariancję) ujawnił statystycznie istotną różnicę (*** P <0,001) pomiędzy typem dzikim (14. 0,9 ogniska / komórkę) i c4446C> wyrażającym G (3,5. 0,2 ognisk / komórki). Paski błędów przedstawiają SEM. (C) MCM8 c.446C> G (p.P149R) hamowało wiązanie DNA przez EMSA. Dzikiego typu MCM8 lub zmutowane białko MCM8 (p.P149R) było związane z losowym 46 nukleotydem ssDNA ssDNA. Żele zostały zobrazowane i przeprowadzono ocenę ilościową frakcji przesunięcia pasma. Dane pasowały do modelu wiązania pojedynczego miejsca zdefiniowanego przez aF [MCM8] / KD + [MCM8], gdzie F jest związaną frakcją, a KD jest stałą dysocjacji. Zmutowany MCM8 (p.P149R, niebieskie kwadraty) wykazywał znaczącą redukcję powinowactwa wiązania DNA dla ssDNA w każdym stężeniu w porównaniu z MCM8 typu dzikiego (WT, czarne kółka). Każdy punkt jest średnią z 3 powtórzeń. Paski błędów przedstawiają SD. Porównaliśmy również wiązanie DNA dzikiego typu i zmutowanego białka MCM8. Wykonano cDNA MCM8 typu dzikiego i zmutowane, które odpowiadają N-końcowi białka, które zgodnie z przewidywaniami wiąże DNA (nukleotydy 1-1104, aa 1-368). Wybraliśmy losowy 46-nitrowy jednołańcuchowy DNA (ssDNA), ponieważ RAD51 jest rekrutowany do końców ssDNA w miejscach uszkodzeń, a MCM8 prawdopodobnie wiąże się w tych miejscach (8). MCM8 typu dzikiego wykazywał wzrost wiązania z ssDNA, przy stężeniu KD = 6,7. 0,8. M (Figura 3C). W przeciwieństwie do dzikiego typu, zmutowany MCM8 nie nasyca wiązania w trakcie miareczkowania, co utrudnia obliczenie KD (nie określono KD). Wyniki te pokazują, że mutacja c4446C> G / p.P149R upośledza zdolność wiązania DNA na N-końcu MCM8. Użyliśmy macierzy SNP i WES w spokrewnionej rodzinie do zidentyfikowania homozygotycznego recesywnego wariantu patogennego w MCM8 (c.446C> G) jako przyczyny nowego zespołu u ludzi charakteryzującego się niewydolnością jajników, niedoczynnością tarczycy i niestabilnością genomu w komórkach somatycznych. Powstała substytucja p.P149R występuje w wysoce konserwatywnym regionie MCM8, który przewiduje wiązanie DNA. Osoby homozygotyczne pod tym względem wykazują dużą liczbę złamań chromosomalnych po ekspozycji na MMC, a mutacja p.P149R hamuje tworzenie ognisk MCM8 w miejscach uszkodzenia DNA
[podobne: olej z konopii indyjskiej opinie, dna moczanowa leczenie ziołami, imbir na przeziębienie przepis ]
[patrz też: młody jęczmień odchudzanie efekty, ciałka ketonowe, olej z konopii indyjskiej opinie ]