Sekwencjonowanie exome ujawnia mutację MCM8, która jest przyczyną niewydolności jajników i niestabilności chromosomów czesc 4

Ekspozycja limfocytów obwodowych na diepoksybutan (0,1 .g / ml) nie powodowała pękania chromosomów w komórkach z tych samych członków rodziny (IV-1 i IV-6), homozygotycznych pod względem mutacji MCM8 c.446C> G. Oceniliśmy 10 komórek metafazowych na pacjenta, ale było mniej niż 0,2 przerwy na komórkę (Tabela dodatkowa 3). Wyniki testu na zawartość proleków sugerują, że MCM8 nie jest częścią ścieżki naprawy DNA anionu Fanconiego. Analiza danych WES od dotkniętych nią sióstr nie ujawniła dodatkowych wariantów, które wpływałyby na funkcję białka w genach, o których wiadomo, że są związane z niestabilnością chromosomu i niewydolnością jajników (Tabela uzupełniająca 4). Figura 2 Mutacja MCM8 upośledza naprawę pękania DNA. Komórki homozygotycznych osobników MCM8 c.446C> G mają upośledzoną zdolność do naprawy pęknięć dsDNA indukowanych przez MMC. Łącznie 4 eksperymentalne grupy traktowano MMC dla każdej próbki. Reprezentatywne komórki metafazowe traktowane 300 nM MMC pokazano u (A) zdrowej i płodnej osobnicy z genotypem MCM8 WT / WT (członek rodziny IV-3), (B) nietkniętym genotypem WT / MT osobnika (członek rodziny III-2 ) i (C) dotkniętej samicy homozygotycznej pod względem patogennego wariantu MCM8 c.446C> G (genotyp MT / MT, członek rodziny IV-1). Strzałki wskazują na przerwy chromosomalne. Oryginalne powiększenie, × 63 / 1,4 dla spredów chromosomowych i × 4 dla wstawek ze spready. Paski skali: 10 .m. (D) Przynajmniej 10 komórek metafazowych użyto do obliczenia całkowitej liczby pęknięć chromosomów na komórkę dla każdego stężenia MMC. Liczba zliczonych zerwanych chromosomów była ograniczona do 60 na komórkę, a liczba z więcej oznaczona jako 60+ przerwa na komórkę. Paski błędów przedstawiają SEM. * P <0,01, ** P <0,001 i *** P <0,0001 za pomocą testu t-tailed. Kompleksy zawierające MCM8 tworzą ogniska w miejscach uszkodzenia DNA (7). Wytworzyliśmy konstrukt MCM8-GFP zawierający mutację 446C> G / p.P149R w celu określenia, czy wpływ miało tworzenie ognisk. Komórki transfekowano konstruktami MCM8-GFP i traktowano 300 nM MMC w celu wywołania uszkodzenia DNA. Stwierdziliśmy, że ekspresja GFP była głównie jądrowa, ze średnią 14. 0,9 jądrowych ognisk GFP na komórkę utworzonych w miejscach uszkodzeń DNA w komórkach eksprymujących MCM8-GFP typu dzikiego (Figura 3, A i B). Stwierdziliśmy, że znacznie mniej ognisk jądrowych GFP uformowało się, średnio 3,5. 0,2 ogniska na komórkę (P <0,001, Figura 3, A i B), w komórkach wyrażających zmutowany MCM8-GFP. Fluorescencja GFP była bardziej rozproszona w całym jądrze i cytoplazmie (Figura 3A). Te eksperymenty pokazują, że mutacja c4446C> G / p.P149R hamuje rekrutację MCM8 do miejsc uszkodzenia DNA. Figura 3 Mutacja MCM8 zaburza tworzenie się ognisk MCM8 i wiązanie DNA. (A) MCM8 c.446C> mutacja G (p.P149R) hamuje tworzenie ognisk MCM8 w miejscach uszkodzenia DNA
[podobne: rezonans magnetyczny kraków cennik, jedzenie niskokaloryczne, szczepionka na meningokoki cena ]
[więcej w: leki przeciwhistaminowe iii generacji, udar pnia mózgu, schuring ]